BI6 Bioteknik och dess tillämpningar — repetition inför studentexamen

Mitä sensori odottaa tästä moduulista

Tämä moduuli palkitsee menetelmäosaamisesta ja perustellusta arvioinnista. Sensori odottaa, että osaat kuvata työkalun toimintaperiaatteen vaiheittain (PCR, elektroforeesi, kloonaus, CRISPR) ja valita oikean menetelmän annettuun ongelmaan: monistetaanko, erotellaanko, luetaanko vai muokataanko. Pohdintatehtävissä ei riitä mielipide — vastauksen on nojattava biologiseen mekanismiin ja tunnistettava sekä hyöty että riski, ja usein myös se, mitä lainsäädäntö sallii. Yleisin tapa menettää pisteitä on kuvata menetelmä ympäripyöreästi ("geeni siirretään toiseen eliöön") ilman entsyymejä, vektoria ja valintavaihetta.

Perustyökalut

• PCR (polymeraasiketjureaktio) monistaa halutun DNA-jakson koeputkessa ilman soluja. Yksi sykli: denaturaatio (noin 95 °C, juosteet erkanevat) → alukkeiden kiinnittyminen (noin 55 °C, lyhyet alukkeet sitoutuvat jakson päihin ja määräävät monistuvan alueen) → pidennys (noin 72 °C, lämmönkestävä DNA-polymeraasi rakentaa uudet juosteet). Jokainen sykli kaksinkertaistaa määrän, joten kasvu on eksponentiaalista: $n$ syklin jälkeen kopioita on $2^n$ kertaa alkumäärä. Herkkyys on sekä vahvuus (pieni näyte riittää) että heikkous (kontaminaatio on suurin virhelähde).
• Geelielektroforeesi erottelee DNA-palaset koon mukaan. DNA on fosfaattirungon takia negatiivinen ja vaeltaa kohti positiivista napaa; koska varaus kasvaa pituuden mukana, erottelevaksi tekijäksi jää geelin huokosverkon kitka — lyhyet palaset kulkevat pidemmälle. Kokostandardi eli markkeri kertoo palasten pituudet.
• Restriktioentsyymit ja ligaasi — restriktioentsyymi katkaisee DNA:n tietystä tunnistussekvenssistä, usein limittäin, jolloin syntyy toisiaan täydentävät tarttuvat päät. Ligaasi liittää palaset yhdeksi rekombinantti-DNA:ksi.
• Vektori — plasmidi tai virus, joka kuljettaa geenin kohdesoluun. Markkerigeeni (esimerkiksi antibioottiresistenssi tai fluoresoiva proteiini) erottaa onnistuneet siirrot.
• Sekvensointi selvittää emäsjärjestyksen. Nykyiset menetelmät ovat nopeita ja halpoja, minkä ansiosta kokonaisia genomeja luetaan rutiininomaisesti.
• CRISPR-Cas9 — tutkijan suunnittelema opas-RNA on täydentävä kohdejakson kanssa ja ohjaa Cas9-nukleaasin oikeaan kohtaan, jossa se katkaisee kaksoisjuosteen. Solun oma korjaus joko liittää päät epätarkasti (geeni rikkoutuu) tai käyttää annettua mallijaksoa (haluttu sekvenssi lisätään). Menetelmän etu on täsmällisyys, halpuus ja nopeus; riskinä ovat kohteen ohi osuvat katkokset.